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Communications Biology volume 5, Article number: 1192 (2022) Citer cet article

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L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est un besoin clinique non satisfait. Le manque de modèles de maladies humaines est un obstacle majeur au développement de médicaments. Nous présentons un modèle biomimétique des interactions des cellules musculaires lisses endothéliales artérielles pulmonaires dans l'HTAP, combinant un dysfonctionnement naturel et induit du récepteur de la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMPR2) avec une hypoxie pour induire l'activation et la prolifération des muscles lisses, qui est sensible au traitement médicamenteux. Les changements spécifiques à BMPR2 et à l'oxygénation dans l'expression des gènes des muscles endothéliaux et lisses, conformes aux observations faites dans les études génomiques et biochimiques de l'HAP, permettent de mieux comprendre les voies pathologiques sous-jacentes et les mécanismes de réponse aux médicaments. Le modèle capture les principaux changements dans le phénotype endothélial pulmonaire qui sont essentiels pour l'induction du remodelage SMC, y compris un axe de signalisation BMPR2-SOX17-prostacycline et offre une approche facilement accessible aux chercheurs pour étudier le remodelage vasculaire pulmonaire et faire progresser le développement de médicaments dans l'HTAP.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie évolutive de la circulation pulmonaire caractérisée par le rétrécissement des artères et des artérioles pulmonaires, entraînant une hypertrophie ventriculaire droite et une insuffisance cardiaque1. On pense que la maladie est déclenchée par des lésions endothéliales dues à une combinaison de deux coups ou plus, tels que des altérations génétiques, une hypoxie et une inflammation, suivies d'une réparation exagérée impliquant une prolifération accrue et une résistance à l'apoptose des cellules dans les couches artérielles intimale et médiale. En plus de cela, la transition endothéliale-mésenchymateuse (EMT), la glycolyse aérobie et la conversion du phénotype contractile différencié des cellules musculaires lisses en un phénotype synthétique prolifératif sont des contributeurs clés au remodelage vasculaire2. Les médicaments existants apportent un certain soulagement symptomatique mais, chez la plupart des patients, n'arrêtent ni n'inversent la maladie3.

Des mutations génétiques rares ont été identifiées qui augmentent la sensibilité au PAH4. Un changement génétique clé est une mutation germinale hétérozygote dans le gène codant pour le récepteur de la protéine morphogénétique osseuse de type II (BMPR2). Des études rapportent des mutations de BMPR2 dans plus de 80 % des cas d'HTAP familiale et environ 20 % des patients atteints d'HTAP sporadique ou idiopathique5. Les formes non génétiques de PAH présentent une expression réduite et une dégradation accrue du récepteur6. Alors que les mutations de BMPR2 et d'autres gènes membres de la superfamille des récepteurs TGF-β sont responsables de la plupart des cas d'HTAP héréditaire, d'autres gènes et loci génétiques ont également été liés à la maladie5,7.

Les modèles animaux ne reproduisent pas entièrement les caractéristiques de l'HTAP humaine, ce qui constitue un obstacle majeur au développement de médicaments8,9. Les organes sur puces sont apparus au cours de la dernière décennie comme une technologie avec un énorme potentiel pour révolutionner la modélisation des maladies in vitro et augmenter la précision et le débit du dépistage pharmacologique et toxicologique. En outre, il est possible de personnaliser le développement de médicaments grâce à l'utilisation de cellules souches pluripotentes induites par le patient et de cellules endothéliales formant des colonies (ECFC).

Ici, nous présentons un modèle microfluidique d'interactions entre les cellules musculaires lisses et endothéliales artérielles pulmonaires humaines cultivées dans les conditions de renversement de BMPR2 et d'hypoxie, les deux déclencheurs connus de l'HTAP. Dans ce manuscrit, ce modèle est appelé modèle à deux coups de HAP. Nous caractérisons les changements fonctionnels et transcriptomiques dans ces cellules et validons les résultats avec l'utilisation de cellules de patients atteints d'HTAP et de souris présentant des mutations BMPR2 invalidantes et une analyse comparative des données transcriptomiques de l'HTAP humaine. L'étude identifie un axe de signalisation BMPR2–SOX17–prostacycline, essentiel à la régulation de la prolifération des cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires et démontre les effets thérapeutiques de l'antagoniste des récepteurs de l'endothéline Ambrisentan10, un inhibiteur de la tyrosine kinase Imatinib11, et de l'AZD5153, un nouvel inhibiteur de la protéine 4 contenant le bromodomaine (BRD4)12.

L'artère pulmonaire sur puce (PA-on-a-chip) a été conçue pour surveiller les réponses des cellules endothéliales et musculaires lisses vasculaires pulmonaires humaines aux interventions thérapeutiques pathologiques et potentielles. Le dispositif à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) comprend deux canaux microfluidiques (200 µm de hauteur × 1000 µm de largeur) séparés par une membrane nanoporeuse en polyéthylène téréphtalate (PET), avec des cellules endothéliales de l'artère pulmonaire humaine (HPAEC) et des cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire humaine (HPASMC) cultivées de part et d'autre de la membrane (Fig. 1a, b). La porosité de la membrane (taille des pores 400 nm, densité 2 × 106 pores/cm2) permet une communication directe entre les cellules, reflétant le rôle de la lame basale dans les artères pulmonaires13,14. Les entrées et les sorties des canaux endothéliaux sont reliées à des tubulures et à des amortisseurs d'impulsions, pour permettre la circulation du milieu de culture, actionnées par une contrainte de cisaillement laminaire sous des débits physiologiques de 6 dynes/cm2, caractéristiques des artérioles pulmonaires humaines15 (Fig. 1c, d et Supplémentaire Figs. 1–3). Les principes de base de la conception ont été dérivés d'un modèle de poumon sur puce16.

a Schéma de principe de l'artère pulmonaire sur puce. b Coupe en Z de l'interface endothéliale-muscle lisse, imagerie confocale fluorescente. HPAEC (vert : VE-cadhérine), HPASMC (rouge : actine musculaire lisse α). Barre = 10 µm. c Une image et un schéma du système de flux mis en place comprenant une pompe péristaltique, des réservoirs de milieu et des puces, perfusé avec du milieu de culture à 6 dynes/cm2. d Interaction fluide-structure (profil de vitesse) dans le canal endothélial, modélisation COMSOL. e Images de contrat de phase (à gauche) et de microscopie fluorescente (à droite) de HPAEC cultivées dans des canaux microfluidiques dans des conditions statiques et d'écoulement, comme indiqué. F-actine : rouge, VE-cadhérine : vert. Barre = 10 µm. f Allongement des cellules endothéliales ; n = 4 puces individuelles par instant. Les barres d'erreur indiquent la moyenne ± SEM d'une ANOVA unidirectionnelle avec un test de correction post-hoc de Tukey. ****P < 0,0001. g Phénotype HPAEC et HPASMC en conditions statiques et sous-verse (48 h) en PA-on-a-chip ; microscopie fluorescente, F-actine (rouge) et VE-cadhérine (vert); Barre = 10 µm. h, i expression de l'ARNm des marqueurs de différenciation endothéliale, PECAM-1 et KLF2 dans les cellules traitées, comme indiqué ; qPCR. ***P < 0,001 ; Test t non apparié. n = 3. j Effets de la thrombine (1 U/mL) sur la fonction de barrière endothéliale dans des HPAEC co-cultivées avec des HPASMC dans des artères pulmonaires sur puce ou dans des boîtes transwell. Le passage de FITC-dextran (1 mg/mL; 1 h) du canal de haut en bas a été utilisé comme mesure de la perméabilité endothéliale. Des cellules provenant de trois donneurs biologiques différents, cultivées sur 3 à 4 puces/puits transpuits par groupe de traitement, ont été utilisées ; n = 10–12. Les barres d'erreur indiquent la moyenne ± SEM d'une ANOVA unidirectionnelle avec un test de correction post-hoc de Tukey. **P < 0,01 ; ****P < 0,0001, comparaisons, comme indiqué.

L'alignement des HPAEC et des HPASMC dans le dispositif rappelait les configurations des cellules artérielles intimales et médiales in vivo (Fig. 1e – g et Fig. 4 supplémentaire). Les HPAEC stimulées par le flux ont montré une localisation jonctionnelle améliorée de la cadhérine endothéliale vasculaire (VE) et une expression significativement élevée des marqueurs de maturité endothéliale PECAM-1 et KLF2 (Fig. 1h, i). La fonctionnalité de la barrière endothéliale a été évaluée en mesurant le passage du dextrane de 40 kDa marqué par fluorescence, qui a un rayon de Stokes similaire à l'albumine plasmatique humaine17, à travers les couches endothéliales et musculaires lisses stimulées par la thrombine, un vasoconstricteur et un facteur de perméabilité connus18. Les HPAEC dans le PA-on-a-chip ont montré une fonction de barrière endothéliale améliorée et une augmentation plus importante de la perméabilité induite par la thrombine par rapport à la ligne de base, par rapport aux témoins non stimulés (augmentation de 3, 9 fois du PA-on-a-chip contre 1, 5 fois plus en culture statique) (Fig. 1j). La co-culture des HPASMC n'a pas affecté la fonction de barrière endothéliale dans les conditions de l'étude (Fig. 5 supplémentaire).

Le système vasculaire de l'HTAP remodelé est caractérisé par un épaississement intimal et médial (Fig. 2a, b). Il existe un besoin important de comprendre comment l'haplo-insuffisance endothéliale de BMPR2, en combinaison avec le deuxième coup créé par l'hypoxie ou l'inflammation, provoque la maladie.

a Schéma de principe du remodelage vasculaire pulmonaire dans l'HTAP. b Coloration α-SMA (rouge) et vWF (vert) dans les poumons sains et HAP. Barre = 50 µm. c Expression de l'ARNm de BMPR2 dans les HPAEC traités par AdCTRLshRNA avec Ad-BMPR2-shRNA-GFP. n = 3 ; **P < 0,01 ; test t non apparié. d Effet de deux coups (hypoxie et renversement de BMPR2, 24 h) sur la perméabilité HPAEC, mesuré par le passage de 40 kDa FITC-dextran (1 mg/mL) du canal supérieur au canal inférieur ; n = 9 jetons individuels. e Effet de l'hypoxie et de l'inactivation de BMPR2 endothélial sur la prolifération de HPASMC (24 h, test EdU). Les cellules ont été non traitées ou traitées avec 10 µM de mésylate d'imatinib pendant 24 h. n = 4–5 jetons individuels. En d, e barres d'erreur sont la moyenne ± SEM ; ANOVA unidirectionnelle avec test de correction post-hoc de Tukey. Les parcelles de volcan montrent des gènes différentiellement exprimés (DEG) dans les HPAEC f traités avec BMPR2shRNA, les HPAEC g dans le modèle PAH à deux coups (shRNA BMPR2 et hypoxie), les HPASMC h dans le modèle PAH à deux coups. Les gènes régulés négativement sont en bleu et les gènes régulés positivement sont en rouge; P < 0,05, seuil de coupure de 0,25 fois. n = 4.

Pour recréer les conditions de la maladie dans le PA-on-a-chip, les HPAEC infectées par le shRNA d'AdBMPR2 ont été exposées à l'hypoxie (2 % d'O2) pendant 24 h. L'infection adénovirale a été optimisée pour obtenir une réduction d'environ 50% de l'expression de BMPR2, reflétant l'haploinsuffisance de BMPR2 dans l'HTAP (Fig. 2c).

L'inactivation et l'hypoxie de BMPR2, séparément ou en combinaison, n'ont pas affecté la perméabilité ou la prolifération endothéliale dans PA-on-a-chip (Fig. 2d et Fig. 6a supplémentaire), contrairement aux observations antérieures en culture cellulaire statique19. La prolifération de HPASMC a augmenté de manière significative dans les conditions à deux coups lorsque l'inactivation de BMPR2 et l'hypoxie ont été combinées (P <0, 01; Fig. 2e). Cette réponse a été inhibée par le mésylate d'imatinib, un inhibiteur du récepteur tyrosine kinase actuellement à l'étude en tant que traitement anti-prolifération de l'HTAP (P <0, 05; Fig. 2e). Aucune perte significative de cellules des canaux endothéliaux ou musculaires lisses n'a été notée et aucun des traitements n'a affecté l'apoptose cellulaire (Figs. 6b, c et 7 supplémentaires).

Les HPAEC témoins et déficientes en BMPR2 co-cultivées avec les HPASMC dans des conditions normoxiques ou hypoxiques ont subi une analyse RNAseq pour identifier les principaux changements transcriptomiques induits dans les conditions à deux coups. L'inactivation de BMPR2 à elle seule a induit l'expression différentielle de 1828 gènes dans les HPAEC (|logFC |> 0, 25, P <0, 05, comparaison avec les témoins), où, comme prévu, la réduction de l'expression de BMPR2 était le changement le plus significatif (variation de −2, 9 fois, p = 2, 07 × 10 − 9) (Fig. 2f). Ces gènes ont montré un enrichissement dans la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), le point de contrôle G2M, les cibles myc, le cycle cellulaire (cibles E2F) et les voies de réparation de l'ADN (Hallmark, FDR < 0,01). Les HPASMC co-cultivées avec ces cellules ont montré une expression différentielle de 751 gènes (Fig. 8 supplémentaire), associée principalement à l'hypoxie, à la glycolyse, à l'EMT et à l'homéostasie du cholestérol (Hallmark, FDR <0, 01).

La combinaison de l'inactivation de BMPR2 avec l'expression différentielle induite par l'hypoxie de 1090 gènes dans les HPAEC et de 895 gènes dans les HPASMC. Le schéma de ces changements est illustré dans des parcelles de volcan (Fig. 2g, h) et des cartes thermiques montrant un regroupement distinct de gènes liés à l'hypoxie, au génotype et à deux coups (Fig. 9 supplémentaire). Une liste des gènes différentiellement exprimés (DEG) dans les HPAEC et les HPASMC dans le modèle à deux coups de PAH est fournie dans les données supplémentaires 1.

Le profilage transcriptionnel des HPAEC à partir du modèle à deux coups a identifié plusieurs gènes liés à des voies PAH connues, notamment la signalisation TGF-β, la voie NOS, la prolifération, l'angiogenèse, la signalisation Notch, l'EndoMT, les canaux ioniques, la fibrose et l'inflammation (Fig. 3a et Fig. 10a supplémentaire). ~ 80% des changements observés pourraient être attribués à l'inactivation de BMPR2, y compris la régulation à la baisse des gènes dans le TGF-β, la voie de signalisation NOS, les protéines jonctionnelles et les médiateurs de signalisation du facteur de croissance. Le DEG induit par l'hypoxie dans les HPAEC déficients en BMPR2 et les données d'analyse de la voie GSEA correspondantes sont fournies dans les données supplémentaires 2 et 3.

Les principaux DEG associés aux maladies cardiovasculaires ont été regroupés en catégories et visualisés sous forme de cartes thermiques de transcriptions par million (TPM). Les voies codées par couleur sont affichées sous les cartes thermiques, avec des symboles de gènes clés agrandis dans les HPAEC a et les HPASMC b. L'état du génotype (contrôle et knockdown BMPR2) et l'état de l'oxygène (normoxie ou hypoxie) sont affichés en haut de la carte thermique dans différentes couleurs, comme indiqué. Les changements dans l'expression génique sont également codés par couleur, le bleu indiquant une expression génique relative plus faible et le rouge indiquant une expression génique relative plus élevée. Chaque colonne représente 1 répétition expérimentale (n = 4/groupe de traitement).

Les HPASMC du modèle PAH à deux coups ont montré des associations avec plusieurs voies impliquées dans le remodelage vasculaire, notamment l'angiogenèse, l'apoptose, l'inflammation, la vasoconstriction et la signalisation TGF-β (Fig. 3b, Fig. 10b supplémentaire). Seulement ~ 30% de ces changements pourraient être attribués au renversement endothélial de BMPR2. Les gènes supplémentaires affectés par l'exposition hypoxique étaient liés à la glycolyse, à l'adipogenèse, au TNF-α, au cycle cellulaire, à la signalisation Rho et aux interactions ECM. Le DEG affecté par le silence HPAEC BMPR2 dans les HPAEC normoxiques et les HPASMC est fourni dans les données supplémentaires 4. Les gènes HPASMC régulés par l'hypoxie dans le modèle à deux coups et les données d'analyse de la voie GSEA correspondantes sont fournis dans les données supplémentaires 2 et 5, respectivement.

Les changements dans l'expression de certaines cibles génétiques HPAEC et HPASMC ont été validés par qPCR et analyse immunofluorescente (Figs. 11 et 12 supplémentaires). Pour valider davantage nos résultats, nous avons mesuré l'activité de l'hexokinase, l'enzyme limitant la vitesse dans le cycle de la glycolyse et des pentoses, dans les HPASMC. L'activité de l'hexokinase dans les HPASMC cultivées dans des conditions basales de contrôle était de 0,86 ± 0,043 nM NADH/min/mL. Il a augmenté dans des conditions hypoxiques (augmentation de 3, 4 ± 0, 9 fois, P <0, 05, comparaison avec les témoins) et a été nettement plus élevé dans les HPASMC cultivées avec des HPAEC dans les conditions à deux coups (augmentation de 6, 3 ± 0, 4 fois, P <0, 0001, comparaison avec les témoins) (Fig. 13 supplémentaire).

Les cellules endothéliales formant des colonies (ECFC) dérivées du sang sont souvent utilisées comme substituts des cellules endothéliales pulmonaires dans l'HTAP et présentent des anomalies dans les principales voies liées à la pathogenèse de la maladie20,21.

Pour déterminer si les effets observés dans le modèle à deux coups de PAH produiraient des résultats similaires dans les cellules dérivées de patients, nous avons choisi de remplacer les HPAEC par des ECFC de patients PAH présentant des mutations BMPR2 invalidantes. Le processus d'isolement et de culture des ECFC est illustré à la Fig. 4a. Les ECFC de HAP n'ont pas montré de différences morphologiques majeures avec les témoins sains (Fig. 4b, c et Fig. 14 supplémentaire). Cependant, conformément aux réponses observées dans le modèle HAP à deux coups, les HPASMC co-cultivées avec des ECFC HAP dans des conditions hypoxiques ont montré une augmentation significative d'environ 2 fois de la prolifération cellulaire (Fig. 4d). Aucun changement dans l'apoptose ECFC et HPASMC n'a été observé (Fig. 15 supplémentaire).

a Diagramme schématique de l'isolement et de la culture des ECFC patients. b Perméabilité des ECFC d'individus en bonne santé et de patients atteints d'HTAP avec des mutations BMPR2 cultivées dans PA-on-a-chip. c Prolifération de ECFC sains et HAP dans PA-on-a-chip dans des conditions normoxiques ou hypoxiques (2 % O2, 24 h), comme indiqué. d Prolifération de HPASMC co-cultivées avec des ECFC témoins ou patients dans des conditions normoxiques ou hypoxiques. n = 4–5 donneurs biologiques, chacun dosé dans une puce séparée. Les barres sont des moyennes ± SEM ; ANOVA unidirectionnelle avec un post-test de Tukey ; *p ≤ 0,05. Les parcelles de volcan montrent e DEG dans les ECFC HAP avec des mutations BMPR2 par rapport aux témoins sains en normoxie, f DEG dans les ECFC HAP par rapport aux témoins sains en hypoxie (modèle ECFC PAH), g DEG dans les HPASMC en hypoxie. En e–gn = 5 donneurs biologiques, chacun dans une puce séparée.

Les ECFC normoxiques de PAH avec mutations BMPR2 ont montré 1065 gènes exprimés de manière différentielle (DEG) par rapport aux témoins sains (Fig. 4e), associés principalement à la signalisation ROS, KRAS, mTOR et à l'adipogenèse (Hallmark, p <0, 01). 15% de ce pool de gènes était partagé avec des HPAEC déficientes en BMPR2 et comprenait des régulateurs clés de l'homéostasie vasculaire tels que DDAH1, CAV1, PDGFB, KLF2, APLN (Données supplémentaires 6). HPASMCS co-cultivé avec des ECFC HAP a montré 972 DEG (Fig. 16 supplémentaire) enrichi en progression du cycle cellulaire (cibles E2F), point de contrôle G2M, phosphorylation oxydative, voies interféron-gamma (Hallmark, FDR <0, 01). Une liste de DEG dans les ECFC déficients en BMPR2 et les HPASMC co-cultivés avec ces cellules dans des conditions normoxiques est fournie dans les données supplémentaires 7.

Les ECFC PAH du modèle ECFC PAH à deux coups (combinant les mutations PAH BMPR2 et l'hypoxie) ont montré 2360 degrés, tandis que les HPASMC ont montré 689 degrés (logFC> 0, 25, P <0, 05) (Fig. 4f, g et données supplémentaires 1). Le regroupement hiérarchique des gènes dans les ECFC et les HPASMC dans différentes conditions expérimentales a révélé des changements spécifiques au génotype et à l'oxygénation dans l'expression des gènes (Fig. 5a, b et Fig. 17 supplémentaire).

Les principaux DEG associés aux maladies cardiovasculaires ont été regroupés en catégories et visualisés sous forme de cartes thermiques TPM. Les voies codées par couleur sont affichées sous les cartes thermiques, avec des symboles de gènes clés agrandis dans un ECFC de PAH et b HPASMC co-cultivés avec des ECFC. L'état du génotype (contrôle et knockdown BMPR2) et l'état de l'oxygène (normoxie ou hypoxie) sont affichés en haut de la carte thermique dans différentes couleurs, comme indiqué. Les changements dans l'expression des gènes sont également codés par couleur, le bleu indiquant une expression génique relative plus faible et le rouge indiquant une expression génique relative plus élevée. Chaque colonne représente 1 donateur ; n = 5 donneurs biologiques/groupes de traitement différents.

L'ECFC DEG du modèle à deux coups a montré un enrichissement dans les voies clés des HAP, y compris l'angiogenèse, l'apoptose, l'EMT, la fibrose, l'inflammation, la prolifération, l'oxyde nitrique, le TGF-β, la signalisation Notch et Wnt (Hallmark, FDR <0, 01) (Fig. 5a et Fig. 18a supplémentaire). Seulement ~ 30% de ces gènes étaient liés à la mutation BMPR2. Les ~ 70% restants de gènes induits par une exposition hypoxique supplémentaire ont montré des liens avec la glycolyse, l'adipogenèse, le cycle cellulaire, la phosphorylation oxydative, la signalisation Rho, la signalisation TNF-α et la sénescence cellulaire (Données supplémentaires 8).

Les gènes HPASMC du modèle ECFC PAH à deux coups ont montré des associations significatives avec l'angiogenèse, l'apoptose, l'hypoxie, l'inflammation, la prolifération, la fibrose et les voies TGF-β (Fig. 5b et Fig. 18b supplémentaire). 38 % de ces gènes pourraient être liés à la perte de fonction de BMPR2, 62 % des modifications étant affectées par l'hypoxie et liées à la glycolyse, au métabolisme des pentoses, au cycle cellulaire et aux réponses immunitaires. Une liste des gènes HPASMC affectés par les mutations ECFC BMPR2 est fournie dans les données supplémentaires 6. Les gènes régulés par l'hypoxie dans ces cellules et les données d'analyse de la voie GSEA correspondantes sont présentés dans les données supplémentaires 2 et 9, respectivement.

Les ensembles de données RNAseq des deux modèles microfluidiques de dysfonctionnement endothélial dans l'HTAP ont été comparés avec des ensembles de données génétiques publiées provenant de greffes pulmonaires IPAH22,23 et d'autres bases de données génétiques avec des associations connues avec des HAP24. Les DEG de nos modèles et d'autres ensembles de données publiés sont répertoriés dans les données supplémentaires 10 et 11. Les résultats de l'analyse comparative sont présentés à la Fig. 6.

Les ensembles de données DEG des modèles adénoviraux à deux coups (modèle PAH) et des modèles ECFC patients (ECFC PAH) de PAH ont été comparés à des études RNAseq précédemment rapportées et à des listes de gènes connus pour être associés à PAH et IPAH. Les graphiques UpSet et les cartes thermiques détaillent l'analyse comparative des ensembles de données de gènes endothéliaux a, b et des ensembles de données de cellules musculaires lisses c, d. En a, c, les plus grands chevauchements de gènes sont surlignés en jaune. Les cartes thermiques en b, d visualisent la similitude des changements d'expression génique entre les deux modèles microfluidiques de PAH, le modèle PAH à deux coups et le modèle ECFC PAH ; les gènes régulés négativement sont en bleu et les gènes régulés positivement sont en rouge. Les ensembles de données RNAseq utilisés pour l'analyse comparative provenaient de PASMC de transplantations pulmonaires IPAH22 (base de données nommée ici IPAH PASMC); PAEC isolés de greffes pulmonaires IPAH23 (appelés ici IPAH PAEC). D'autres ensembles de gènes comparatifs comprenaient des gènes avec des associations de PAH connues 24 (ici nommés « PAH2 connu ») et la base de données publique DisGENET https://www.disgenet.org/search, où les ensembles de gènes suivants ont été obtenus : DisGENET PAH (https://www.disgenet.org/browser/0/1/0/C2973725/), (ici nommé « PAH1 connu »); DisGENET IPAH (https://www.disgenet.org/browser/0/1/0/C3203102/) (nommé ici « connu IPAH1 »).

Le plus grand nombre de gènes endothéliaux partagés a été trouvé entre nos deux modèles microfluidiques PAH (212 gènes), entre le modèle microfluidique ECFC PAH et l'ensemble de données de gènes IPAH PAEC (63 gènes) et entre le modèle PAH à deux coups et l'ensemble de données IPAH PAEC (33 gènes)24 (Fig. 6a et données supplémentaires 11). L'analyse de la voie GO (Hallmark) des ensembles de données de gènes endothéliaux qui se chevauchent a révélé leurs associations avec les principales voies des HAP, y compris l'EMT, la signalisation TNF-α via NFkB, l'hypoxie, l'apoptose et la voie p53 (FDR < 0,05) (Données supplémentaires 12).

De manière constante, le plus grand nombre de gènes SMC exprimés de manière différentielle partagés a été trouvé entre nos modèles microfluidiques PAH (94 gènes), entre le modèle ECFC PAH à deux coups et les PASMC IPAH25 (86 gènes) et entre le modèle HPAEC PAH à deux coups et les PASMC IPAH (76 gènes) (Fig. 6c et données supplémentaires 10). L'ensemble de gènes SMC partagé a montré des liens avec la signalisation TGF-β, la glycolyse, le métabolisme des acides gras, la voie des pentoses phosphates, le TNF-α via la signalisation NFκB, le cycle cellulaire/point de contrôle G2M (analyse de la voie GO, FDR < 0,05) (Données supplémentaires 13).

La perte de SOX17 endothélial était l'un des changements les plus importants observés dans les cellules déficientes en BMPR2 dans les modèles microfluidiques de bases de données PAH et PAH. De manière constante, l'expression de SOX17 était nettement réduite dans l'endothélium pulmonaire de souris porteuses d'une mutation invalidante du domaine de liaison au ligand de BMPR2 (BMPR2C118W) 26 (Fig. 7a – c et Fig. 19 supplémentaire). Une localisation nucléaire réduite de SOX17 a également été notée dans les HPAEC hypoxiques déficients en BMPR2 (Fig. 7d et Supplémentaire Fig. 20).

a Images confocales représentatives de coupes pulmonaires de souris de type sauvage et BMPR2 (C118W/+) avec SOX17 (rouge) et vWF marquant l'endothélium (vert) et les noyaux en bleu (DAPI), comme indiqué ; Barre = 50 µm. Les flèches pointent vers les noyaux cellulaires. Les images agrandies des zones encadrées sont affichées dans le coin supérieur droit. b, c Graphiques correspondants montrant l'expression de SOX17 et du vWF dans les tissus pulmonaires de souris, comme indiqué. d Images confocales montrant la localisation de SOX17 dans les HPAEC déficientes en BMPR2 (shRNA BMPR2) et les contrôles (shRNA contrôle), comme indiqué. Les flèches pointent vers les noyaux cellulaires. Barre = 10 µm. e Parcelle volcanique montrant les protéines DE induites par SOX17, avec la prostacycline synthase (PTGIS) marquée en rose et les protéines d'intérêt sélectionnées mises en évidence. f Effet de la surexpression endothéliale de SOX17 sur la prolifération des HPASMC dans le modèle à deux coups (BMPR2shRNA + hypoxie), avec et sans inhibiteur du récepteur de la prostacycline, RO1138452 (10 µM). g, h Effet de l'ambrisentan et de l'AZD5153, inhibiteur de BRD4, sur la prolifération des HPASMC dans des modèles d'HAP à deux coups, utilisant des HPAEC déficients en BMPR2 ou des ECFC d'HAP, comme indiqué. En b, cn = 6/groupe. ***P < 0,0001, test t de Student ; Dans en = 4–6, *P < 0,05 comparaison avec le contrôle normoxique, #P < 0,05, comparaison comme indiqué ; ANOVA unidirectionnelle avec post-test de Tukey. En gn = 4–8, en hn = 5–10.

Pour étudier le rôle potentiel de SOX17 endothélial dans la régulation de la prolifération PASMC, une surexpression compensatoire de SOX17 a été induite dans les HPAEC déficients en BMPR2. SOX17 a empêché une augmentation de la prolifération des PASMC dans les conditions à deux coups (Fig. 7e). L'analyse protéomique quantitative des HPAEC surexprimant SOX17 a identifié 20 médiateurs potentiels de cette réponse, notamment la prostacycline synthase (PTGIS), la prostaglandine réductase (PTGR2), la superoxyde dismutase 1 (SOD1), le Dickkopf WNT Signaling Pathway Inhibitor 2 (DKK2) et le facteur de type Krüppel 16 (KLF16). Une augmentation de l'expression de la prostacycline synthase était le changement le plus significatif observé (augmentation de 2,5 fois, P = 0, 006) (Fig. 7f). Les abondances de protéines normalisées et brutes dans les groupes d'étude sont fournies dans les données supplémentaires 14–16.

L'inhibiteur sélectif du récepteur de la prostacycline RO113845227 a aboli les actions anti-prolifératives de SOX17, réaffirmant le rôle clé de la prostacycline dans la régulation de la prolifération PASMC dans les conditions de la maladie à deux coups.

La prostacycline exerce des effets vasodilatateurs et anti-prolifératifs sur les CML vasculaires et sa déficience a été liée à l'expression réduite de PTGIS dans les PAH28,29. Nous avons identifié huit sites de liaison SOX17 prédits dans le promoteur PTGIS et onze sites de liaison dans ses régions activatrices putatives, suggérant une interaction régulatrice directe (Fig. 21 supplémentaire). Plusieurs sites de liaison SOX17 ont également été trouvés dans les promoteurs et les amplificateurs d'autres gènes pertinents pour les HAP, notamment PTGIS, PTGR2, DKK2, à l'exception de SOD1, qui ne comprenait qu'un seul site de liaison SOX17 prédit dans l'un de ses amplificateurs.

Pour tester si la prolifération PASMC induite dans les conditions à deux coups est sensible au traitement avec des médicaments pertinents pour les HAP, Ambrisentan, un antagoniste sélectif approuvé par la FDA du récepteur A ET-1 et AZD5153, un composé d'une classe structurelle d'inhibiteurs BET, ont été ajoutés au système d'écoulement. Deux motifs de liaison BRD (ogives) d'AZD515329 permettent une liaison bivalente et confèrent une puissance élevée pour BRD4, différenciant ce médicament des alternatives, y compris l'apabétalone (RVX-208)12. Aux concentrations cliniquement pertinentes10,12, l'ambrisentan et l'AZD5153 ont inhibé efficacement la prolifération des PASMC (Fig. 7g, h).

Nous présentons un modèle d'organe sur puce des interactions des cellules endothéliales vasculaires et des cellules musculaires lisses qui permet l'étude des changements dynamiques du phénotype cellulaire moléculaire et fonctionnel dans des conditions de flux physiologiques en réponse à des facteurs clés liés au développement de l'HAP, tels que le silençage de BMPR2 et l'hypoxie. L'étude décrit les changements de phénotype des cellules endothéliales pulmonaires nécessaires à l'induction de l'activation et de la prolifération du muscle lisse médian et souligne l'importance potentielle d'un lien entre BMPR2 et un déterminant de l'identité artérielle, SOX17, dans la régulation de cette réponse. Le modèle peut accueillir des cellules endothéliales dérivées du sang des patients, offrant la perspective d'adapter les médicaments aux patients individuels. La prolifération des PASMC, une caractéristique clé de l'hyperplasie médiale, a été atténuée par cinq médicaments présentant différents modes d'action, validant l'utilisation de cette plateforme pour le dépistage des médicaments. La conception expérimentale et les principaux résultats sont résumés à la Fig. 8.

Les HPAEC et les ECFC HAP traités au shRNA AdBMPR2 avec des mutations BMPR2 invalidantes ont été co-cultivés avec des HPASMC dans des conditions hypoxiques (2% O2) dans PA-on-a-chip pendant 24 h. Le diagramme montre des gènes et des voies de PAH clés sélectionnés identifiés par le profilage transcriptomique des cellules musculaires endothéliales et lisses.

La plupart des porteurs de la mutation BMPR2 et des animaux knock-out hétérozygotes pour BMPR2 ne développent pas spontanément d'HTAP et un deuxième coup est nécessaire pour la manifestation complète de la maladie4. Conformément à cette prémisse, une combinaison d'inactivation de BMPR2 endothélial avec hypoxie dans PA-on-a-chip était nécessaire pour induire la prolifération de HPASMC. Les mécanismes par lesquels la déplétion endothéliale de BMPR2 amorce les cellules vasculaires pour la maladie et convergent avec les effets du second coup ne sont pas bien compris. En utilisant une combinaison d'essais fonctionnels, de séquençage d'ARN et d'analyse des voies dans les cellules endothéliales et musculaires lisses pulmonaires humaines et les cellules de patients atteints d'HTAP présentant des mutations BMPR2 invalidantes dans les conditions à deux coups, nous avons identifié une signature microfluidique des réponses vasculaires caractéristiques de l'HTAP. Fondamentalement, cet ensemble de données génétiques a montré un chevauchement substantiel avec les modifications transcriptomiques signalées dans les HAP et identifié des cibles génétiques d'intérêt potentiel.

La perte de BMPR2 dans les HPAEC a inhibé l'expression des gènes de la famille TGF-β impliqués dans la différenciation vasculaire, l'angiogenèse et la maturation des vaisseaux, ce qui est cohérent avec les changements rapportés dans l'HAP. Les HPAEC ont également montré une expression réduite des marqueurs jonctionnels CDH5 (VE-cadhérine), GJA5 (connexine 40) et de plusieurs intégrines, susceptibles de prédisposer l'endothélium aux dommages induits par le stress.

Les HPAEC déficientes en BMPR2 ont également montré une expression réduite des enzymes de biodisponibilité du NO, NOS3, DDAH1 et DDAH2, ce qui est compatible avec la vasculopathie des PAH31,32. D'autres changements clés liés aux HAP comprenaient une réduction des facteurs d'identité artérielle SOX17, SOX18 et KLF2 ainsi que des régulateurs de l'angiogenèse, de la prolifération et du comportement de germination endothéliale. L'exposition de ces cellules endothéliales déficientes en BMPR2 à l'hypoxie a modifié l'expression des gènes contrôlant le transport de l'oxygène, le cycle cellulaire, la régulation transcriptionnelle et l'inflammation, y compris les gènes ayant des liens bien documentés avec l'HAP : KCNK33,34, HDAC435, BRD412, CAMK2G36,37 et ICAM138. Pour résumer, le modèle microfluidique à deux coups offre un aperçu des processus observés au cours du développement de la maladie, associés à une perte d'identité artérielle, à une signalisation eNOS réduite et à une sensibilité accrue aux dommages, accompagnée d'une inflammation et d'un déplacement métabolique vers la glycolyse.

L'expression génique différentielle dans HPASMC co-cultivée avec des HPAEC déficientes en BMPR2 dans le modèle PAH à deux coups a été enrichie pour les phénotypes spécifiques à la maladie associés à l'angiogenèse, l'apoptose, l'inflammation, la vasoconstriction et la signalisation TGF-β. La régulation à la baisse des gènes de la matrice extracellulaire (collagènes, fibronectine, laminine, ténascine), les modulateurs de la migration et de la prolifération des SMC (serpine, périostine, cavéoline39 et apéline40) et la régulation à la hausse des métalloprotéinases matricielles sont susceptibles de compromettre l'intégrité structurelle artérielle et de stimuler la migration et la prolifération des SMC41,42. Une autre observation notable concernait une réduction des canaux potassiques plasmalemmiques, KCNMA, KCNAB2 et KCNK1 dans ces cellules, un changement lié à la vasoconstriction pulmonaire et au remodelage vasculaire43. Conformément au phénotype pro-prolifératif des HPASMC dans les conditions de double coup, nous avons observé une multiplication par 6 de l'activité de l'hexokinase, une enzyme clé qui contrôle le taux de glycolyse et le cycle des pentoses, les deux voies clés qui fournissent de l'énergie et des métabolites pour les cellules à croissance rapide.

Les cellules endothéliales formant des colonies (ECFC) dérivées du sang des patients présentent des anomalies caractéristiques de l'HTAP, suscitant l'intérêt pour leur application en médecine personnalisée20,21. Pour valider notre modèle, nous avons utilisé des ECFC de patients présentant des mutations BMPR2 invalidantes à la place des HPAEC appauvries en BMPR2. L'analyse comparative des réponses cellulaires a révélé plusieurs similitudes importantes entre les deux types de cellules. Conformément aux changements observés dans les HPAEC déficientes en BMPR2, les ECFC avec des mutations de BMPR2 ont montré une régulation à la hausse des gènes inflammatoires (IL6, REL, NFKB1, NFKB2, CXCL1, 2, 3, 8, TRAF1, ICAM3), la glycolyse (HK2, LDHA, PDK4) et la fonction mitochondriale (FIS1, STOML2)44 et une régulation à la baisse des marqueurs clés de l'identité artérielle ( ERG et SOX17)45. Cependant, contrairement à la réponse observée dans les HPAEC, les ECFC ont montré une régulation à la hausse des gènes régulant la biodisponibilité du NO (NOS3, DDAH1, DDAH2) et une expression accrue des gènes favorisant la réparation endothéliale et l'angiogenèse (VEGFA, VEGFB, FGF2, CLIC1, RAC1, ROCK1, ARF6, KLF2, KLF6, KLF7), ce qui peut refléter la propagation incontrôlée des réponses cellulaires endothéliales réparatrices. dans les HAP46 avancés.

Un lien entre BMPR2 et SOX17 rapporté dans cette étude est intrigant, compte tenu de l'association de la variation des deux gènes avec la sensibilité au PAH5,47. La perte de SOX17 endothéliale était nécessaire à l'induction de la prolifération des PASMC dans les conditions de deux coups et nous avons identifié la prostacycline synthase (PTGIS) et la prostacycline, comme médiateurs probables de cette réponse. Établir la nature précise des interactions de SOX17 avec PTGIS et d'autres gènes impliqués dans les processus pathologiques de l'HTAP tels que PTGR248, SOD149, modulateur de la voie Wnt, DKK250,51 ou régulateur du métabolisme des lipides et de la résistance à l'insuline, KLF1652 dépasse le cadre de cette étude et nécessitera une enquête plus approfondie.

L'antagoniste des récepteurs de l'endothéline cliniquement approuvé, l'ambrisentan, et un nouveau médicament candidat, l'inhibiteur de BRD4, l'AZD5153, ont été efficaces pour inhiber la prolifération des PASMC dans les modèles microfluidiques inductibles comprenant des HPAEC déficients en BMPR2 et des ECFC dérivés de patients. BRD4, membre de la famille BET (bromodomaine et motif extra-terminal), est un modulateur transcriptionnel clé de l'apoptose et de la prolifération cellulaire et un moteur épigénétique essentiel pour les maladies cardiovasculaires12. Conformément aux observations dans les poumons de PAH12, l'expression de BRD4 était significativement élevée dans les HPAEC cultivées dans les conditions à deux coups, par rapport aux témoins sains et non traités.

L'utilisation économique des cellules, la courte durée d'expérimentation, l'évolutivité de l'appareil et les faibles coûts de production et d'exploitation font de notre PA-on-a-chip un modèle attrayant pour les tests de dépistage de drogues. Le seul autre modèle existant de PAH-on-a-chip53,54 comprenait des cellules intimales, médiales et adventitielles des artères pulmonaires de PAH cultivées dans des canaux droits disposés côte à côte, avec un contact cellule à cellule limité aux espaces entre les poteaux en silicone situés entre les canaux54. Ce modèle peut fournir des informations précieuses concernant la régulation paracrine de la migration cellulaire, mais ne peut pas évaluer la fonction de barrière endothéliale et est limité par une mauvaise accessibilité du matériel pulmonaire du patient, ce qui empêche son application plus large dans la recherche et les tests de médicaments. Notre appareil, qui n'accueille que deux types de cellules, est peu susceptible de refléter pleinement la pathophysiologie complexe de l'HTAP et, par conséquent, l'approvisionnement futur en cellules dérivées de patients et l'introduction d'autres types de cellules seront une considération vitale. La conception actuelle devrait encore être améliorée pour permettre la migration des cellules entre les deux couches vasculaires, une réponse liée au remodelage vasculaire dans l'HTAP. Une telle approche consisterait à augmenter la taille des pores dans la membrane séparant les deux canaux microfluidiques.

Les modèles animaux ont contribué à déchiffrer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la maladie, mais sont souvent critiqués pour ne pas reproduire entièrement la pathologie de la maladie humaine et pour leur faible succès dans la traduction clinique de nouveaux médicaments8. Les avantages et les limites des modèles animaux d'HTAP ainsi que les nouvelles mesures entreprises pour améliorer leur valeur translationnelle ont été résumés dans les deux excellentes revues récentes8,55,56. Notre modèle a reproduit avec succès les caractéristiques de la maladie précédemment décrites dans l'HTAP humaine et animale, telles que la prolifération cellulaire médiale et l'activation des voies associées à l'HTAP dans les cellules intimales et médiales artérielles pulmonaires. Cependant, compte tenu des limites de ce modèle, telles que le manque de complexité, la variabilité associée à la diversité génétique, l'âge et les comorbidités des donneurs56, ainsi que les différences potentielles dans les protocoles de fabrication entre les laboratoires, une attention particulière à la conception rigoureuse de l'étude56, y compris la validation des données avec des modèles animaux robustes, peut être nécessaire dans les futures applications de dispositifs dans les études précliniques exploratoires et de confirmation sur les HAP.

En résumé, nous fournissons un modèle microfluidique et inductible de dysfonctionnement des cellules vasculaires, informant des effets fonctionnels et transcriptomiques du déficit endothélial en BMPR2 et de l'hypoxie. Des chevauchements importants avec des listes préexistantes de gènes PAH exprimés de manière différentielle se prêtent à la découverte/validation de cibles et peuvent potentiellement être appliqués pour une utilisation dans le dépistage de médicaments ou la toxicologie.

Des photomasques individuels ont été conçus pour les chambres de cellules endothéliales et musculaires lisses à l'aide d'AutoCAD 2017 (Autodesk, CA, USA) et imprimés sur des films de photomasques haute résolution (Micro Lithography Services Ltd, UK). La photolithographie, la lithographie douce et la fabrication d'artère pulmonaire sur puce ont été réalisées dans une salle blanche de classe ISO 5 (<100 000 particules/m3). Une description détaillée des étapes de fabrication est fournie dans les méthodes supplémentaires.

Des simulations basées sur la méthode des éléments finis ont été utilisées pour simuler l'interaction fluide-structure dans le dispositif PA sur puce à l'aide de COMSOL Multiphysics version 4.4. Une description détaillée du modèle développé est fournie dans les méthodes supplémentaires. Les paramètres du modèle de murs PDMS sont présentés dans le tableau supplémentaire 1.

Des HPAEC (PromoCell, Cat. n° C-12241) de 3 à 4 donneurs biologiques différents ont été cultivées dans des flacons de culture tissulaire T75 (Sarstedt, Allemagne, Cat. n° 833911002) recouverts de 10 μg/mL de fibronectine (10 μg/mL, EMD Millipore Corp, USA ; 341631) dans un milieu de croissance de cellules endothéliales 2 (ECGM-2, Promocell, Allemagne C-22211), additionné de 2 % de sérum de veau fœtal (FCS) et d'un mélange de facteurs de croissance (PromoCell, n° de catalogue C-22111), 1 % de streptomycine/pénicilline (100 μg/mL) et 1 % de MycoZap™.

Les HPASMC (Lonza, Cat. No. CC-2581) ont été cultivées dans des flacons de culture tissulaire T75 recouverts de 0,2 % de gélatine porcine (Sigma, Cat. No. G1890) dans un milieu de croissance de cellules musculaires lisses 2 (SmGM-2, PromoCell, Cat. No. C-22062), additionné de 5 % de FBS et d'un supplément de facteur de croissance (PromoCell, Cat. No. C-39267) et d'antibiotiques. . Les cellules ont été acquises au passage 3 et ont été utilisées pour des expériences dans les passages 4 à 6. Les informations sur les donneurs sont fournies dans le tableau supplémentaire 2. Pour la co-culture HPAEC et HPASMC, le milieu ECGM-2 a été complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS). Le VEGF, l'acide ascorbique, l'héparine et l'hydrocortisone, connus pour inhiber la prolifération des HPASMC, ont été exclus.

Pour induire l'hypoxie, les cellules ont été incubées dans un incubateur humidifié à 37 ° C réglé à 5% de CO2 et 2% d'O2.

Les cellules formant des colonies endothéliales humaines (ECFC) ont été dérivées d'échantillons de sang périphérique et caractérisées, comme décrit précédemment57. Des échantillons de sang veineux ont été obtenus avec l'approbation du comité d'éthique local et le consentement écrit éclairé (REC Ref. 17/LO/0563) de volontaires sains (n ​​= 5) et de patients HPAH avec des variantes pathogènes rares du BMPR2 (n = 5). Les ECFC ont été cultivés dans des flacons de culture tissulaire T75 recouverts de gélatine porcine à 1 % (Sigma, n° cat. G1890) dans du milieu EGM-2 (CC-3156, Lonza Biologics, Slough, Royaume-Uni), additionné de facteurs de croissance (CC-4176, EGMTM-2 bullet kit, Lonza), 10 % de FBS (HyClone, Thermo Scientific, South Logan, UT, USA) et 1 % d'antibiotique/anti solution mycotique (Gibco, Invitrogen, Paisley, Royaume-Uni). Tous les ECFC ont été utilisés entre les passages 3 et 6.

Les caractéristiques démographiques et cliniques des sujets sains et des patients atteints d'HTAP sont présentées dans le tableau supplémentaire 3 et les variantes de mutation IPAH BMPR2 sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 4.

HPAEC et HPASMC ont été co-cultivés dans un insert Transwell contenant une membrane en polyéthylène téréphtalate (PET) avec des pores de 0,4 µm et une densité de pores de (2,0 ± 0,4) × 106 pores/cm² (Cat. No. 353180, Corning, USA). Un protocole détaillé est fourni dans les méthodes supplémentaires.

Les canaux microfluidiques ont été stérilisés pendant la fabrication à l'aide de plasma d'oxygène et en outre stérilisés sous lumière UV pendant 30 min. Les entrées/sorties des canaux non utilisés dans cette procédure ont été recouvertes de 3 M Magic Tape. Les puces sélectionnées pour être utilisées ont été rincées avec de l'éthanol à 100 %, suivies de deux lavages avec du PBS stérile. Avant l'ensemencement des cellules, les canaux microfluidiques ont été remplis de collagène de queue de rat stérile à 100 μg/mL (BD Biosciences, Royaume-Uni ; n° de catalogue 354236) dans de l'acide acétique 20 mM (Honeywell, Royaume-Uni ; n° de catalogue 695092) et incubés pendant 1 h à température ambiante. Après le revêtement, 150 000 HPASMC en suspension dans 15 μL de milieu de co-culture ont été ensemencés dans le canal du muscle lisse (inférieur). La puce a été retournée et placée dans un incubateur humidifié à 37 ° C pendant 2 h pour permettre la fixation des cellules. La chambre musculaire lisse a ensuite été doucement rincée avec un milieu de co-culture pour éliminer les cellules non attachées et la puce a été remise en position verticale. 150 000 HPAEC ou ECFC en suspension dans 15 μL (10 000 cellules/μL) de milieu de co-culture ont été ensemencés dans le canal endothélial (supérieur) et incubés pendant 2 h à 37 °C. Les canaux des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses ont ensuite été doucement rincés avec 200 μL de milieu de co-culture pour éliminer les cellules non adhérentes, avant de connecter les ports d'accès aux réservoirs de médias personnalisés (Cambridge Glassblowing, Royaume-Uni) via un tube flexible de 0,8 mm ID (IBIDI, Allemagne, cat. No. 10841). Le milieu a été perfusé à l'aide d'une pompe à rouleaux REGLO ICC 4 canaux 12 (Cole-Parmer, Royaume-Uni, n° de catalogue ISM4412), utilisant un tube de pompe Ismatec, PharMed® BPT, 0,76 mm ID ; 100 pieds (Cole-Parmer, Royaume-Uni, n° cat. WZ-95809-24) et Ismatec Pump Tubing, 3-Stop, PharMed® BPT, 0,76 mm ID (Cole-Parmer, UK, n° cat. WZ-95714-24). Des séparateurs de flux barbelés en polypropylène de style Y de 0,8 mm de diamètre intérieur ont été utilisés pour répartir le flux entre deux puces dans un circuit de flux indépendant (IBIDI, Allemagne, n° de catalogue 10827). Toutes les puces ont été perfusées avec un débit de 6 dynes/cm2.

Des HPAEC confluentes à environ 90 % cultivées dans des plaques à six puits ont été infectées avec Ad-Control-shRNA-GFP (Vector Biolabs, USA ; Cat. No. 1122) ou Ad-BMPR2-shRNA-GFP (Vector Biolabs, USA ; Cat. No. shADV-202207) (titre 1 × 108 PFU/mL) à la multiplicité d'infection (MOI) de 1:750. Trois heures plus tard, les milieux ont été changés et les cellules ont été incubées pendant 24 à 48 h avant une nouvelle expérimentation. Les efficacités de transfection ont été déterminées par comptage de cellules fluorescentes et l'inactivation de BMPR2 a été confirmée par qPCR et Western blot. Dans certaines expériences, AdSOX17 (Vector Biolabs, USA, Cat no. ADV-224019) a été ajouté pendant 24 h au MOI 1:500 pour induire une surexpression compensatoire de SOX17.

Des procédures expérimentales détaillées sont décrites dans les méthodes supplémentaires. En bref, les cellules ont été lavées dans du PBS, trypsinisées et centrifugées pendant 5 min à 5000 x g. L'ARN total a été extrait à l'aide d'un kit Monarch Total RNA Miniprep (n° cat. T2010S ; New England Biolabs, MA, USA) ou du kit RNeasy Plus Micro (n° cat. 74034 ; Qiagen, Allemagne). Des doubles élutions ont été effectuées pour maximiser la récupération d'ARN à partir de colonnes de centrifugation. Les niveaux d'ARN totaux ont été quantifiés à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop™ ND2000 (Thermo Scientific, Royaume-Uni).

50 ng (provenant de puces) ou 100 ng (provenant de tous les autres échantillons) d'ARN extrait ont été rétrotranscrits en ADNc à l'aide d'un kit LunaScript RT SuperMix (Cat. No. E3010L; New England Biolabs, MA, USA). Les composants du mélange réactionnel RT et du cycle RT sont détaillés dans les tableaux supplémentaires 5 et 6. Les composants du mélange maître qPCR et les conditions du cycle qPCR sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 7.

Toutes les séquences d'amorces ont été conçues à partir de séquences FASTA (PubMed, NCBI). La liste des amorces est présentée dans le tableau supplémentaire 8.

Le séquençage d'ARN de nouvelle génération de HPAEC transfectés avec Ad-shCTL ou Ad-shBMPR2, HPASMC, ECFC volontaires sains et ECFC de PAH avec 4 à 5 réplicats biologiques, a été réalisé à l'Imperial British Research Council Genomics Facility (Imperial College London, Royaume-Uni). La qualité et la quantité d'ARN ont été déterminées à l'aide d'un système Tapestation (Agilent Technologies, Royaume-Uni). 50 ng d'ARN total de haute qualité (RNA Integrity Number Score ≥ 8,0) ont été utilisés comme matériau de départ. L'enrichissement en ARNm polyadénylé a été réalisé à l'aide d'un module d'isolation magnétique d'ARNm NEBNext® Poly (A) (n° de catalogue E7490L ; New England Biolabs, MA, USA). Les bibliothèques d'ARN ont été préparées à l'aide d'un kit de préparation de bibliothèque d'ARN directionnel NEBNext® Ultra™ II (réf. E7760L ; New England Biolabs, MA, États-Unis), conformément au protocole du fabricant. Les échantillons ont été indexés à l'étape d'enrichissement par PCR de la préparation de la bibliothèque d'ARN avec NEBNext Multiplex Oligos pour Illumina 96 Unique Dual Index Primer Pairs (Cat. No. E6440L; New England Biolabs, MA, USA). Le séquençage de l'ARN a ensuite été effectué sur un Illumina Hiseq4000 Paired End 75 avec double indexation (Illumina, CA, USA) produisant environ 25 à 30 millions de lectures par échantillon.

Les données de séquençage brutes (fichiers fastq) ont été alignées sur un transcriptome humain de référence (GENCODE version 34) à l'aide de Salmon (v1.4.0)58 pour produire des estimations d'abondance de transcrits. Les estimations ont été converties en données d'expression génique dans RStudio (https://www.R-project.org/) à l'aide du package R tximport. L'expression génique différentielle a été réalisée à l'aide de edgeR (v3.30.3)59, qui utilise le package limma R (v3.44.3)60 adapté pour optimiser les performances de sélection des gènes exprimés de manière différentielle dans un nombre relativement faible de répliques biologiques. Cette analyse a été corrigée pour au moins deux composantes principales, chaque composante expliquant individuellement > 1 % de la variance dans l'ensemble de données. Les gènes ont été considérés comme différentiellement exprimés si la valeur P était <0,05 et le changement de facteur absolu était >0,25. L'annotation fonctionnelle et l'enrichissement des gènes ont été effectués à l'aide du logiciel GSEA (Broad Institute, MIT; UC San Diego) et Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Qiagen) en utilisant des corrections de tests multiples de taux de fausses découvertes intégrées. Avant l'analyse GSEA, les gènes qui respectaient les seuils DGE étaient pré-classés conformément aux directives de Reimand et al.61 et étaient analysés à l'aide des collections d'ensembles de gènes suivantes de la base de données de signatures moléculaires (MSigDB) : Hallmark62, KEGG63 ou Reactome64. Les packages R suivants ont été utilisés pour produire des graphiques sélectionnés : Parcelles de volcan utilisant EnhancedVolcano (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) ; dot plots utilisant ggplot2 (https://ggplot2.tidyverse.org); cartes thermiques utilisant pheatmap (https://cran.r-project.org/package=pheatmap).

Les ensembles de données RNAseq utilisés pour l'analyse comparative provenaient de HPASMC isolées à partir de greffes pulmonaires IPAH22 et de HPAEC isolées à partir de greffes pulmonaires IPAH23. D'autres bases de données de gènes avec des associations HAP connues ont été téléchargées à partir des données supplémentaires 424 (site Web public de Disgenet https://www.disgenet.org/search ; DisGENET PAH (https://www.disgenet.org/browser/0/1/0/C2973725/), DisGENET IPAH (https://www.disgenet.org/browser/0/1/0/C3203102/.

La concentration en protéines des échantillons de HPAEC (n = 3/groupe) a été déterminée par le test de Bradford et les protéines ont été digérées pour l'analyse MS par digestion en pot unique. La digestion a été stoppée par l'ajout de TFA et un dessalage immédiat. Le dessalage a été effectué à l'aide de plaques HLB uElution (Waters) avec un collecteur à vide. Les peptides dessalés ont été élués, séchés et quantifiés dans un dosage peptidique. Par la suite, les échantillons ont été ajustés à 0,1 µg/µl pour LC-MS et injectés dans une colonne piège C18 de 180 µm × 20 mm (NanoEase M/Z Symmetry, Waters). Les peptides ont été séparés sur une colonne C18 de 75 µm × 200 mm (nanoEase M/Z HSS T3, Waters) sur un Acquity M-Class UPLC (Waters) interfacé avec un spectromètre de masse Synapt G2S (Waters). Les données ont été acquises en mode de résolution positive, en utilisant HDMSE sur 50–2000 m/z avec un temps de balayage de 0,5 s avec une masse de verrouillage acquise pour 3 balayages toutes les 1 min (leucine-enképhaline). Pour les balayages à haute énergie, l'énergie de collision a été augmentée entre 19 et 45 V avec une tension de cône de 40 V. Les échantillons ont été randomisés et chaque échantillon a été espacé d'un blanc pour éviter le report.

Les données ont été traitées à l'aide de Progenesis QI pour la protéomique avec correction de masse de verrouillage (556,2771 Da), avec une sélection de pics effectuée avec les paramètres par défaut, mais la charge maximale est définie sur 6. Les données ont été recherchées à l'aide d'un protéome de référence humain (Swissprot, téléchargé le 28/06/2021) avec digestion à la trypsine et jusqu'à 2 clivages manqués spécifiés. L'oxydation de la méthionine a été réglée sur variable et la carbamidométhylation de la cystéine a été réglée sur une modification fixe. Le filtrage FDR a été effectué à 4 %, avec 3 fragments par peptide, 5 fragments par protéine et 1 peptide par protéine.

Les coordonnées de la région promotrice des gènes étudiés ont été choisies sur la base des GeneHancer Identifiers65 fournis dans Genecards66. Une description détaillée de l'analyse est fournie dans les méthodes supplémentaires.

Des prédictions ont été faites à l'aide de motifs SOX17 humains et de souris, qui partagent des domaines de liaison à l'ADN identiques, avec l'utilisation de la bibliothèque de gènes humains CIS-BP. Les sites de liaison SOX17 dans les régions promotrices et activatrices des gènes étudiés sont présentés dans les tableaux supplémentaires 9 et 10.

La perméabilité endothéliale dans les boîtes Transwell et dans le PA-on-a-chip a été évaluée par spectrophotométrie en mesurant le passage de 1 mg/mL 40 kDa FITC-Dextran (FD40S, Sigma Aldrich, Dorset, UK) à travers la couche endothéliale et musculaire lisse57. Dans certaines expériences, 1 U/mL de thrombine (T7513, Sigma Aldrich, Dorset, Royaume-Uni) a été ajoutée au milieu de co-culture. Une description détaillée des protocoles expérimentaux est fournie dans les méthodes supplémentaires.

Les protocoles de fixation cellulaire et d'immunocoloration sont décrits dans les méthodes supplémentaires. Des coupes histologiques de tissus pulmonaires de patients atteints d'HTAP naïfs de traitement lors d'une transplantation pulmonaire (n = 2) et des tissus témoins comprenant des régions non impliquées d'échantillons de lobectomie provenant de 2 poumons de donneurs inutilisés provenaient des archives de tissus du Hammersmith Hospital, Imperial College de Londres. Les procédures d'immunocoloration détaillées et les listes d'anticorps sont fournies dans les méthodes supplémentaires. Une liste des anticorps primaires et secondaires utilisés est présentée dans le tableau supplémentaire 11.

Cette étude a utilisé des coupes pulmonaires d'une étude publiée26. Tous les travaux avec des animaux ont été menés conformément à la loi britannique de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) et approuvés par la licence de projet Home Office 80/2460.

La prolifération cellulaire a été quantifiée à l'aide d'un kit d'essai de prolifération cellulaire EdU (EdU-594, EMD Millipore Corp, USA, Cat. No. 17-10527) conformément aux instructions du fabricant. Les cellules positives pour EdU ont été visualisées sous un microscope à champ large Zeiss AxioObserver fluorescent (Carl Zeiss AG, Allemagne). Les images et les z-stacks ont été prises avec un objectif ×10 et ont été analysées avec le logiciel ImageJ. Les données sont présentées sous forme de pourcentage du nombre de cellules EdU-positives par rapport au nombre total de cellules.

L'activité de l'hexokinase a été mesurée dans des échantillons regroupés de PASMC (1,5 × 105 cellules/traitement) à l'aide du kit de dosage de l'hexokinase (Abcam, ab136957), conformément au protocole du fabricant.

Imatinib Mesylate (Enzo life sciences, UK; Cat. No. ALX-270-492-M025) et Ambrisentan (Astra Zeneca) ont été ajoutés directement au milieu de culture cellulaire à des concentrations cliniquement pertinentes de 10 µM67 et 1,25 nM10, respectivement. L'inhibiteur de BRD4, AZD5153 (Astra Zeneca) a été ajouté à la concentration de 16,5 nM, sur la base de l'utilisation préclinique des inhibiteurs de BET12 et des expériences dose-réponse in vitro. Les cellules ont été incubées avec les inhibiteurs pendant 24 h dans des conditions normoxiques (21% O2) ou hypoxiques (2% O2) en conséquence.

L'apoptose a été mesurée à l'aide d'un test Click-iT Plus TUNEL pour le kit de détection d'apoptose in situ avec le colorant Alexa Fluor 647 (Life Technologies, n° de catalogue C10619), conformément aux instructions du fabricant. Les cellules positives au TUNEL ont été visualisées sous un microscope à champ large Zeiss AxioObserver fluorescent (Carl Zeiss AG, Allemagne). Les images et les piles z ont été prises sous un objectif × 10 et analysées avec le logiciel ImageJ. Les données sont présentées sous forme de pourcentage du nombre de cellules TUNEL-positives par rapport au nombre total de cellules.

Des piles Z 3D de tranches d'image carrelées de 5 µm d'épaisseur de canaux microfluidiques ont été acquises au microscope à champ large AxioObserver. Dans les canaux microfluidiques, les cellules endothéliales (HPAEC ou ECFC) étaient marquées en vert : soit les cellules surexprimaient l'AdGFP, soit leurs noyaux étaient immunocolorés avec un anticorps anti-Erg. Les noyaux des cellules en prolifération (HPAEC/ECFC et HPASMC) ont été marqués en rouge (EdU-594) et les noyaux de toutes les cellules ont été marqués en bleu (DAPI). Les piles d'images ont été aplaties et trois régions d'intérêt de 500 µm × 1000 µm ont été sélectionnées à l'avant, au milieu et à l'extrémité de chaque canal, dans la zone de chevauchement HPAEC/HPASMC. Pour faciliter le comptage des cellules, un script ImageJ personnalisé a été développé qui a généré un masque binaire noir/blanc de signatures fluorescentes (cellules et noyaux) dans chaque canal de couleur. Les cellules vertes avec des noyaux bleus ont été classées comme EC au repos, les cellules vertes avec des noyaux bleu/rouge ont été classées comme des EC proliférantes et les cellules restantes (non vertes) avec des noyaux bleus uniquement et des noyaux bleu/rouge uniquement, ont été classées comme SMC quiescentes et SMC proliférantes, respectivement. Des comptages ont été effectués dans chaque canal de couleur avant de superposer des images avec un masque binaire DAPI pour produire des comptages finaux. Les comptages sélectionnés ont en outre été vérifiés par notation manuelle des cellules dans chaque canal fluorescent à l'aide des plugins Grid et CellCounter dans ImageJ.

Le logiciel d'analyse ImageJ a été utilisé pour mesurer l'alignement et l'allongement des cellules. L'alignement a été déterminé comme l'angle entre le grand axe de la cellule et l'axe horizontal de l'image à 180° et les valeurs ont été exprimées en pourcentage de cellules à un angle d'orientation particulier ; L'allongement a été déterminé comme 1- circularité [axe long/axe court de la cellule].

Des procédures détaillées de lyse cellulaire, d'électrophorèse et de transfert Western sont fournies dans les méthodes supplémentaires. Les anticorps primaires et secondaires utilisés pour le transfert Western sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 12. L'intensité de la bande a été déterminée par densitométrie à l'aide du logiciel ImageJ. L'expression des protéines d'intérêt a été normalisée à la β-actine.

Tous les graphiques ont été tracés dans le logiciel RStudio ou Graphpad Prism 8 (Graphpad Software Inc, CA, USA), avec des tests statistiques effectués, le cas échéant. Dans les graphiques à barres, les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne (SEM). Les données sources pour les graphiques se trouvent dans les données supplémentaires 17. Lors de la comparaison de deux groupes d'échantillons, les données normalement distribuées ont été analysées à l'aide d'un test t de Student non apparié. Pour les comparaisons de deux groupes d'échantillons ou plus, une ANOVA à un ou deux facteurs a été utilisée, selon le cas. Le seuil de signification statistique était P < 0,05.

Des échantillons de sang veineux ont été obtenus avec l'approbation du comité d'éthique local et le consentement écrit éclairé de volontaires sains et de patients idiopathiques atteints d'HTAP avec l'approbation du comité d'éthique et le consentement écrit éclairé (REC Ref 17/LO/0563). Les participants ont été identifiés par un numéro.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires, à l'exception des données de séquençage de l'ARN, qui ne peuvent être partagées publiquement en raison de la nature sensible et du risque d'identification des patients. Les données sont disponibles auprès de l'Imperial College London Institutional Data Access/Ethics Committee (contact via Mme Becky Ward, Research Governance Manager, E : [email protected]) pour les chercheurs qui répondent aux critères d'accès aux données confidentielles. Toute autre information est disponible sur demande auprès de l'auteur correspondant.

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Cette recherche a été soutenue par la bourse de doctorat BHF FS/17/64/33476 (Alex Ainscough), la subvention de projet PG/19/19/34286 de la British Heart Foundation, la subvention RE/18/4/34215 du BHF Imperial Center of Research Excellence et la subvention ICIC (MRC) Confidence in Concept 20/21 4050789012. Programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 (conventions de subvention n° 724300 et 875525). Nous remercions le personnel du NIHR Imperial Clinical Research Facility, Hammersmith Hospital (Londres, Royaume-Uni), M. Lee Tooley de l'atelier d'instrumentation mécanique de l'Imperial College pour son aide dans la fabrication des racks et des plateaux pour le système d'écoulement, M. Joshua Dodd (Morgan Branding) pour son aide dans la préparation des illustrations scientifiques, le Dr Hebah Sindi (Imperial College London) pour son aide à l'immunomarquage des coupes pulmonaires humaines et le Dr Sandro Satta (Imperial College London) pour son aide à l'optimisation des extractions d'ARN et q PCR. Nous sommes particulièrement reconnaissants à M. Steve Rothery (Imperial FILM facility) pour son aide et ses conseils en matière d'acquisition et d'analyse d'images. Toutes les analyses d'imagerie à champ large/confocale ont été effectuées au Facility for Imaging by Light Microscopy (FILM) de l'Imperial College de Londres, qui est en partie financé par le Wellcome Trust (subvention 104931/Z/14/Z) et le BBSRC (subvention BB/L015129/1).

Institut national du cœur et des poumons, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

Alexander J. Ainscough, Maike Haensel, Christopher J. Rhodes, Adam Fellows, Eleni Vasilaki, Luke S. Howard, John Wharton, Martin R. Wilkins et Beata Wojciak-Stothard

Département de chimie, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

Alexander J. Ainscough, Timothy J. Smith et Joshua B. Edel

National Phenome Centre and Imperial Clinical Phenotyping Centre, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

Harry J. Whitwell

Section of Bioanalytical Chemistry, Division of Systems Medicine, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

Harry J. Whitwell

Unité des innovations émergentes, Sciences de la découverte, R&D biopharmaceutique, AstraZeneca, Cambridge, Royaume-Uni

Kelly Gray et Adrian Freeman

Département de médecine, École de médecine clinique de l'Université de Cambridge, Addenbrooke's and Royal Papworth Hospitals, Cambridge, Royaume-Uni

Benjamin Dunmore et Paul D. Upton

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AJA a réalisé la fabrication de puces, conçu et réalisé des expériences, analysé des données et rédigé le manuscrit ; TS a effectué des simulations informatiques in silico et a rédigé le manuscrit ; CJR a fourni le code et a aidé à effectuer l'analyse RNAseq et a évalué de manière critique le manuscrit ; EV a effectué une analyse des sites de liaison SOX17 ; SS et AF ont effectué des qPCR ; MRW, JW & LSH ont fourni du matériel patient et évalué de manière critique le manuscrit ; KG et AF ont fourni une étude de dépistage de drogues soutenue par des composés médicamenteux ; HW a effectué une analyse protéomique; PDU et BD ont fourni des tissus pulmonaires de souris mutantes BMPR2 ; MH a effectué la fabrication de puces et des expériences ; JBE a fourni des conseils sur les simulations in silico, la conception et la fabrication de puces, obtenu un financement et évalué de manière critique le manuscrit. BWS a conçu l'étude, conçu des expériences, obtenu un financement et rédigé le manuscrit.

Correspondance à Beata Wojciak-Stothard.

L'ambrisentan et l'AZD5153 utilisés dans cette étude ont été fournis par Astra Zeneca.

Communications Biology remercie Fakhrul Ahsan, Sébastien Bonnet et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Éditeur principal de la manipulation : Eve Rogers. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Ainscough, AJ, Smith, TJ, Haensel, M. et al. Un modèle d'organe sur puce d'hypertension artérielle pulmonaire identifie un axe de signalisation BMPR2-SOX17-prostacycline. Commun Biol 5, 1192 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04169-z

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Reçu : 04 mai 2022

Accepté : 25 octobre 2022

Publié: 07 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04169-z

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